T4 DNA Ligase(Fast)

储运条件：-20℃

产品组成

注： 1 U=1 Weiss unit

产品简介

T4 DNA Ligase(Fast) 由携带 T4 噬菌体 gene 30 的大肠杆菌产生。 该酶催化双螺旋 DNA 或 RNA 之间的 5'- 磷酸基团和 3'- 羟基之间形成磷 酸二酯键。该酶在双链 DNA、RNA 或者 DNA/RNA 复合物间可修复单链 缺刻 , 并且可以连接有粘性末端或者平末端的 DNA 片段，但对于单链核 酸无活性，主要用于限制性内切酶酶切产物 DNA 片段克隆、基因定点突 变与 PCR 产物克隆、线性 DNA 自环化与修复双链 DNA 缺刻。 T4 DNA Ligase(Fast) 需要 ATP 作为辅助因子，在室温下完成粘性末端连接反应 仅需 10 分钟。

酶活单位定义

37℃条件下，1 Weiss unit 的酶在 20 min 内催化 1 nmol 的 [32PPi] 转变为活性炭吸附态。  1 Weiss unit 等同于约 200 个粘性末端连接反应单 位（CEU） ，相当于在 16℃条件下，30 min 内连接 50% HindIII 消化后 的 λDNA 片段。

酶活检测条件

酶活在如下反应混合物中进行测试：  66 mM Tris-HCl (pH 7.6) ，6.6 mM MgCl2 ，66 μM ATP ， 10 mM DTT ，3.3 μM [32PPi]。

质量控制

核酸内切酶残留检测

37 ℃ 条 件 下， 将 200 U 的 T4 DNA Ligase(Fast) 与 1 μg 的 pUC19 DNA 中温育 4 h，未检测出由共价闭合环状 DNA 转变为带有 缺刻的 DNA。

核酸外切酶残留检测

将酶液与双链 DNA 底物在 37℃温育 16  h，通过 DNA 电泳检测 双链 DNA 底物无变化。

蓝白斑测试

室温条件下，使用 30 U T4 DNA Ligase(Fast) 连接 pUC57 DNA/ HindIII，pUC57 DNA/PstI 或 pUC57 DNA/SmaI 消化产物 1 h，然后用 E.coli XL1-Blue 感受态细胞转化连接产物，检测到少于 1% 的白斑。

使用方法

1. DNA 插入片段连接至载体 DNA  （粘性末端连接）

① 于冰上配制如下反应体系：

② 充分混匀并瞬离，  22℃温育 10 min；

③ 取 1~5 μl 的连接产物用于 50 μl 化学感受态细胞的转化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 电转感受态细胞的转化。

注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁 DNA 代替热失 活步骤。

2. DNA 插入片段连接至载体 DNA  （平末端连接）

① 于冰上配制如下反应体系：

②充分混匀并瞬离，  22℃温育 1 h；

③ 取 1~5 μl 的连接产物用于 50 μl 化学感受态细胞的转化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 电转感受态细胞的转化。

注：如果连接反应产物用于电转化，应使用离心柱或者氯仿抽提清洁 DNA 代替热失 活步骤。